Cell counting 10^4 이유 - Cell counting 10^4 iyu

Q. cell 카운팅 공식에서 10^4 하는이유

cell 카운팅 공식에서혈구계산판으로

큰사각형 4개에 있는 cell 수 계산 후

cell수 x 1/4 x 10^4 x 희석배율 로 공부했습니다

근데 10^4 하는이유가 0.1uL에있는 세포수여서 ml로 계산하기위해 

10^4 를 곱하는 이유로알고있었는데 이것이 아니라고합니다.

10^4 하는 이유가 다른게 있을까요? 

채택답변

큰 사각형 1개의 크기가 1 x 1 x 0.1mm입니다.

따라서 부피는 0.1ul이기 때문에 1ml로 환산하려면 10000x를 해야합니다.

<본 정보는 네티즌에 의해 작성된 정보로, BRIC에서 추가적인 검증과정을 거친 정보가 아님을 밝혀드립니다.>

이 글을 쓰는 나도 실험을 ㅈㄹ 잘한다든가, CNS에 논문을 투고 하는 능력자는 아니다. 그냥 학부생과 대학원 처음 들어온 학생들을 위해서 경험을 공유하는 것 정도이니 핏대를 세우며 비판하기 보다는 틀린 부분 있거나 다른 부분이 있으면 위트있게 지적질 해주시면 감사하겠다. 나름 업계 동업자 아닌가?ㅋ

실험을 하면서 cell counting 을 하는 것은 기본이다. 각 조건의 cell 수를 동일하게 하는 것 부터가 변인 통제이니까. MTT assay 같은 실험들은 특히나 더하다.  하지만 FM이라고 다 지켜지든가... 많은 사람들이 대략적인 방법으로 cell counting을 대신하며 실험한다. 내 경우에는 cell이 자라는 plate의 면적을 기준으로 해서 split(혹은 passage)를 하는 것인데. 크게 틀리는 것은 아니지만 cell이 과밀하게 자라있다든가 반대로 너무 적은 상태라면 잘 맞지 않는다. 즉, 내가 이정도 cell 이면 ~%가 찼다라고 확실하게 말할 능력이 없다면 추천하지 않는 방법이다.(실험 잘 하는 사람은 이렇게 해도 잘 한다. 될 놈은 어떻게 해도 된다. 젠장!)

cell counting 하는데에는 Hemocytometer라는 기구가 필요하다. 그리고 그건 이렇게 생겼다.

그리고 현미경을 통해 그 안을 보면 아래와 같은 격자 모양이 가득하다. 그리고 나중에 cell 을 셀 때에 동그라미 안에 포함된 4부분을 세고 평균을 낸다. 꼭 그렇냐? 그건 아닌 듯 하다. youtube에 올라와 있는 동영상을 보면... 동그라미 부분 빼고 나머지를 세는 사람도 있다. 근데 가운데 부분은 격자가 촘촘해서 세기도 힘들고 cell 이 뭉쳐 있을 확률이 커서 보통은 뺀다.

나는 다음과 같은 방법으로 cell counting을 한다. 

1. Media 제거하고 PBS로   wash한다.

2. Trypsin을 1~2ml  cell 에 뿌려주고 incubation한다. incubation 시간은 cell 마다 다르다. 

    (ATCC 찌라시를 참고하라. - 적당량의 2~3배의 시간이 써 있는 것 같다! 빌어먹을.)

3. Plate 옆을 손바닥으로 가볍게 톡톡 쳐본다. cell 이 떨어지면 media를 1~2ml 처리한다. 

    (media 에 들어있는 FBS가 trypsin의 작용을 방해한다.)

4. 15ml conical tube에 넣고 centrifge 한다.

5. 1ml Media 에 녹인다. 

6. 1/10 정도 떼내고 그걸 다시 micro centrifuge tube(e-tube) 에서 1/10 정도로 다시 희석한다.

    (여기가지 dilution factor 10 x 10 = 100)

7. 그중에 10ul를 trypan blue 10ul 랑 섞는다.

    (여기가지 dilution factor 10 x 10 x 2 = 200)

8. 혼합용액 10ul를 사진에 보는 것과 같이 홈을 통해 집어 넣는다.

9. Trypan blue로 염색되지 않은 cell을 counting 한다.

   (한 부분에 cell 의 수가 10개 이하, 100개이상이 되지 않도록 하는게 좋다고 한다.)

10. 계산.

저기 동그라미로 표시된 네모부분(격자 16칸) 의 넓이는 1 mm^2 이다. 그리고 그 깊이는 0.1 mm 다. 즉 부피가 0.1 mm^3 이 되는데 이 부분의 부피를 ml 단위로 환산하면 10^-4 ml 이된다.(계산해 달라고? 그냥 외워라. 설명하기 귀찮다. 절대 산수가 약한 게 아니다.)

다시 계산으로 돌아가 보자. 만약 4 부분의 cell 의 평균이 14 개가 나왔다면? 거기에 지금까지의 dilution factor를 다 곱해주면 된다. 미디어 1ml에 있는  cell의 개수는 

14x 10 x 10 x 2 x 10^4 cell/ml = 2.8 x 10^7 cell/ml 이 된다.

아 그래도 숫자에 약하다. 10으로 딱딱 떨어지는 수가 마냥 좋다 하시는 사람들은 이걸 또 언제 계산해서 쓰고 있나 하며 좌절할지도 모른다. 그래서 1ml에 2.8x10^7 이라면... media 1.8ml을 더 넣으면 1x 10^7 cell/ml로 맞춰진다! 하하하. 머리가 나쁘면 꼼수라도 써야한다. 

이것도 어려운 아해들이 있는가? 아쉽게도 생명과학과에는 산수를 싫어하는 학생들이 너무나 많다.(나는 아니다! 나는 아니다!) 수능때는 어느 정도 머리가 돌아간 것 같은데. 지금은 계산기가 없으면 실험 못할 것 같은 분들을 위해 IT 동지들이 좋은 어플을 선사했다. 세월이 참 좋긴 좋다. 구글 플레이 스토어에서  cells calculator 를 쳐보시기 바란다. 아주 쉽게 cell counting 을 할 수 있다. 

마지막으로 글로만 배우면 꼭 안되는 분들을 위해 youtube 동영상을 띄워 놓는다. 보면서 이미지 트레이닝 하면 좋을 듯 싶다. 

참고 1) split 혹은 passage라고 하는 것은 cell culture에서 cell을 다른 plate에 옮기는 것을 의미한다. cell은 주변의 cell과 접촉하게 되면 증식을 멈춘다.(contact inhibition) 따라서 실험에 필요한 cell을 많이 키우기 위해서는 기존에 있던 cell을 여러  plate에 나누어 키워야 한다. 이 과정을 split이라 한다.

참고 2) trypsin과 같은 enzyme을 사용하거나 EDTA를 이용하여  cell 을  plate 바닥으로 부터 떼어낼 수 있다. trypsin은 enzyme으로 cell adhesion molecule의 중간을 잘라 cell 을 떨어뜨리는 방법이고 EDTA는  adhesion에 필요한 양이온들을 잡아서 cell 을 떼어내는 방법이다. EDTA가 cell 에 입히는 피해는 적다하고 하나... 시간이 오래 걸리고 잘 안 떼어진다나... 난 잘 모르겠다.

참고 3) 정상적인 상태에서 cell이라면 trypsin 잠깐 친 걸로는 거의 죽지 않는다. 그리고 어차피 죽은 cell 이라면 나중에 다른 plate 에 분주하면 떠오를테니 난 그냥 산 cell만 센다. 푸르게 보이는 cell이 많다면... 그 때는 좀 세야하지 않을까... 

참고 4) 눈금선 위에 있는 cell은 어떻게 하느냐가 좀 고민인데, 사실 정답은 없는 것 같다. 어느 조건에서나 같은 양을 깔아주는 게 목적인 이상, 확실하게 자신의 기준을 세우고 세면 될 듯하다.