혈구계-Hemocytometer  혈구계(Hemocytometer 또는 Haemocytometer)는 원래 혈구세포를 세기 위해 고안되었지만 현재 현미경상으로 볼 수 있는 대부분의 입자들을 세는데 사용되고 있다(예, 정자등의 세포수 계수, 플랑크톤 계수 등) Hemocytometer는 Louis-Charles Malassez가 고안한 것으로 챔버를 가진 사각형의 두꺼운 유리 슬라이드 글라스로 만들어 져있다. 이 챔버에는 현미경으로 관찰 할 수 있는 미세한 격자가 레이저로 조각되어 있다. 혈구계는 이 챔버의 두께와 격자의 면적을 이용하여 일정 용량내의 세포 또는 입자를 계수한 후 희석배율등을 고려하여 전체 용액내의 세포, 입자수를 계산할 수 있다. 잘 섞여진 샘플용액에서 마이크로 피펫을 이용하여 적당량(약 50ul정도?)을 혈구계의 주입구로 주입한다. 혈구계의 슬라이드글라스와 커버글라스내에는 일정량의 용량만 수용할 수 있도록 고안되어 있으므로 조금 로딩하여 기다리면 모세관 현상에 의해 빨려들어간 후 전체적으로 잘 펴지게 된다. (만일 운동성이 있는 샘플이라면 사전에 포르말린 등을 처리.....) <혈구계 단면도> 혈구계내의 격자(Grid)의 구성, 격자의 부피(Voulume) Hemocytometer grid: red square = 1 mm^2, 100 nl green square = 0.0625 mm^2, 6.25 nl yellow square = 0.04 mm^2, 4 nl blue square = 0.0025 mm^2, 0.25 nl at a depth of 0.1 mm. 각각의 격자내에 있는 입자수를 편의에 따라 계수한 후 다음 식에 따라 원래 용액 내의 입자의 밀도를 구한다. 원래용액속의 입자밀도=(계수된 입자의 수/(계수한 챔버의 proportion)X(샘플을 희석한부피/원래샘플의 부피) 원리는 이러하지만.....보통의 경우 일반적으로 편리하게 아래의 방법을 이용하여 사용한다. 아래그림에서 제일 큰 사각형의 네 귀퉁이를 차지하는 사각형 내의 셀수를 계수한다. 계수하는 이 사각형의 면적은 1mm^2이다. 4개의 사각형에 들어있는 입자의 수를 모두 계수한 다음 평균을 구한 다음 1ml당 개체수로 환산하기 위해 104을 곱하여준다. 예) 이들의 평균은 57.3이고 이것은 1mm2 x0.1mm=0.1mm^3의 부피내에 들어있는 입자의 수가 평균 갯수가 될 것이다.
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목적 2. 실험 이론 및 원리 참고 자료Freshney, R. I., 1987, Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique (2nd Edition), Alan R. Inc., New York. 태그이 자료와 함께 구매한 자료
세포 준비과정에서의 추가 정보안녕하세요! 오늘은 지난 포스팅에 이어 hemocytometer 사용법과 세포수 계산에 대해 알아볼게요. 혹시 지난 포스팅을 아직 보지 않으신 분들은 먼저 보시고 오는 것을 추천합니다. 앞서 작성한 글에서 조금 더 추가하고 싶은 내용도 있기 때문이에요. 세포수를 측정하기 위해 배양중인 세포를 준비할때 방법에서 세포를 trypsin을 이용하여 떼어준다는 그 부분에서 배지를 제거한 후, DPBS washing을 진행하여 배지를 완전히 제거해요. 배지에는 부착할 수 있게 해주는 Ca+이온과 trypsin 저해제가 함유되어 있는데 이때 DPBS를 사용하여 배지를 제거해주면 Trypsin/EDTA의 역할을 더울 활성화 될 수 있도록 도와주는 역할을 해요. trypsin처리로 부착세포가 떨어지게 되면 더이상 trypsin역할을 할 필요가 없고 세포의 생존률 저하는 물론이고 단백질 실험을 하는 경우 영향을 미치기 때문에 배지를 첨가하여 trypsin 활성을 없애줍니다. 자 이렇게 조금 더 부가 설명을 덧붙이니 실험 방법에 대해 이해하기 훨씬 수월해진 것 같지 않나요! 세포배양에 대해 조금 더 자세히 다룰 시간이 있다면 나중에 한번 포스팅해볼게요! 전처리 후 Hemocytometer사용법그럼 이제 준비된 세포를 이용하여 세포수를 측정해볼게요. 세포의 양에 따라 배지를 분주한 후, one cell로 떨어진 세포를 trypan blue라는 염색 시약을 이용하여 염색시켜줄거에요. 1. trypan blue 10ul에 cell suspension 10ul를 1:1로 섞어줍니다. 이때 세포가 죽은 것은 까맣게 염색되고 세포가 죽지 않은 것 즉 살아있는 세포는 약간 테두리쪽이 염색 된 것처럼 보입니다. 2. hemocytometer위에 cover glass를 올린 후 그 사이의 좁은 틈으로 10ul를 분주합니다. 3. 그럼 좁은 틈으로 들어가면서 쫙 퍼집니다. 이때 기포가 생기지 않도록 조심해야해요. 4. 그 후, 세포를 세어줍니다. 보통은 1, 2, 3, 4칸의 ㄱ(빨간색)또는 ㄴ(검은 선)으로 세포를 세어줍니다. 5. 그 후, 세어진 cell의 개수 / 4 (4칸 세었으니까) * 2( trypan blue 1:1섞었기에) * 10^4(한칸의 부피가 10^-4이므로1ml당 들어있는 세포의 수를 알고싶기때문에 10^4를 곱해줌) 6. 이렇게 ml당 세포수가 나왔으면 total cell suspension을 곱하면 suspension 양 당의 세포수가 나오게 됩니다. 7. 보통 필요한 세포의 수는 세포 배양 기간과 실험의 조건에 따라 양이 나뉘며 필요한 세포를 깔고 싶을때 몇 ul를 넣어야 하는지 계산하면 됩니다. count한 세포수: 총 volume = 필요한 세포 수 : 필요한 volume이 되는거죠. 치환을 하면 (필요한 세포/ count한 세포수) * 필요한 volume 을 하면 얼마를 넣어야 하는지 나와요. 이때 총 volume이 dish에 4ml이 들어간다면 4- 필요한 cell suspension volumed을 한 만큼 dish에 배지를 넣으면 됩니다. 8. 그 후, 세포와 배지가 잘 섞이도록 또 cell이 뭉치지 않고 monolayer로 잘 깔리도록 dish를 조심히 흔들어줍니다. 여기서 세포 monolayer로 까는 팁 tip!세포와 배지를 dish에 넣고 세포가 부착되지 않은 상태에서 흔들어줘야 해요. 이때 dish를 위아래 대각선으로 두번씩 섞어주고 잠깐 dish를 놔둡니다. 아주 잠깐이에요. 현미경으로 세포를 관찰했을때 뭉친곳이 있는지 한번 확인해줍니다. 잘 깔려있지 않을 가능성이 커요. 그래서 한번더 같은 방법으로 위, 아래, 대각선으로 두번씩 dish를 움직여 흔들어줘요. 그렇게되면 세포가 딱 골고루 분포되있답니다. 이후에 배양하면 세포가 monolayer로 dish에서 자라게 돼요. 이상 세포배양시 필요한 세포수 세는 법과 hemocytometer사용법 그리고 세포를 monolayer로 까는 팁까지 알아봤어요. 다들 세포배양에 도움이 되었으면 좋겠네요 감사합니다~ |
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