자동혈구세척기 관리 - jadonghyeolgusecheoggi gwanli

●자동혈구분석기 (자동혈액분석기) 역사

자동혈구분석기는 1960년대 처음으로 개발되어 혈색소, 헤마토크리트, 적혈구수, 백혈구수 등을 측정하였고, 1970년대에는 혈소판수와 백혈구의 세 가지 감별계산도 가능하게 되었다. 1980년대에는 평균적혈구용적(MCV), 평균적혈구혈색소량(MCHC), 평균적혈구농도(MCH), 적혈구분포폭(RDW), 평균혈소판용적(MPV), 다섯 가지 백혈구의 감별계산 및 유핵세포(nucleated RBC)의 검출, 망상적혈구까지 측정이 가능한 장비로 발전하였다.

●자동분석기 측정 원리  

1) 혈색소

2) 혈구측정 :

전기저항(electrical impedence)

원리를 이용한 혈구수 측정에서 적혈구는 전기전도성(radiofrequency conductivity)이 떨어지는 반면 희석제는 우수한 전도체인 사실에 근거하고 있다. 전류가 흐르는 용액에서 세포가 소개구(aperture)를 통과할 때 발생하는 전기저항을 측정한다. 이 때 저항(voltage pulse) 수가 세포수가 되고 저항의 크기는 세포 크기가 된다.

이러한 소위 전기저항 원리를 주로 채택한 기기는 Sysmex (XE-2000), Beckman-Coulter Series 일부, Abbott Diagnostics의 Cell-Dyn Series 일부이다.

그림설명 Schematic diagram of particle counter in which changes in electrical resistance are counted as voltage pulses. A, Aperture; CS, cell suspension; E1 and E2, platinum electrodes; EC1 and EC2, electrical contacts; GC, glass cylinder; M, mercury column; V, valve; VP, vacuum pump.

광산란(light scattering)

원리는 혈구세포들의 희석부유액에 수직 방향으로 빛(laser)을 쪼이면 빛이 세포의 크기와 과립성에 따라서 각각 다르게 반사되고 산란되는데 이것을 여러 각도에서 검출하여 측정하는 원리로 Siemens Advia 2120이 대표적인 장비이다. 한편 Beckman-Coulter 및 Cell-Dyn 자동혈구분석기는 전기저항과 산란광을 함께 이용하여 혈구를 분석하도록 개발되었다.

세포화학(cytochemistry)

ADVIA 120/210/2120i 자동혈구분석기에 적용한 가장 큰 장점중의 하나는 백혈구의 과산화분해효소(peroxidase) 활성도를 측정하기 위한 세포화학 반응이다. 평균 과산화분해효소 지표(mean peroxidase index, MPXI)로 표현되는데 중성구, 호산구 및 단핵구에 나타나는 상대적인 양성도와 광산란으로 부터 측정된 데이타를 종합하여 백혈구 감별계산에 이용한다. ABX Diagnostics 사에서는 세포화학 시약을 사용하여 백혈구를 원래 상태로 고정시키고, 이어서 chloraxol black F로 세포를 염색한다.  

3) 히스토그램(histogram) :

적혈구, 백혈구, 혈소판 등의 크기(x축)와 상대적인 숫자(y축)를 나타내는 분포도로 세포화학적 성질과 광산란의 원리가 더 첨가되어 백혈구 감별계산이 가능하며 검사의 정도관리, 질병의 진단과 치료효과의 판단에 유용하다. 예를 들어 철결핍빈혈, 만성질환빈혈, 혈색소병증, 용혈빈혈, 거대적모구빈혈, 한랭응집질환, 백혈병 분류, 패혈증, 화학요법 효과판정 및 혈뇨의 진단과 치료판정까지 유용성은 다양하다.

그림설명   White blood cell (WBC) scattergrams/cytograms. Top left, Abbott CELL-DYN 4000 WBC scatterplot, light scatter vs. volume. Top right, Sysmex XT 2000i, WBC scattergram, side-scattered light vs. side fluorescence. Bottom left, Siemens Advia 120, WBC peroxidase cytogram. Bottom right, Coulter LH 750, WBC scattergram, light scatter vs. volume.  

4) 자동혈구분석기의 백혈구 감별계산 (WBC Differential)

    LUC (large unstained cells) 의미와 유핵적핵구 계산

자동혈구분석기의 백혈구 감별계산은 주로 유세포분석기를 이용하여 세포의 물리적 및 생화학적인 성상을 근거로  산출한다. 그런데 자동혈구측정기는 기본으로 다섯가지의 백혈구(호중구, 림프구, 단구, 호산구, 호염구)를 감별하고 내부 기준에 따라 다섯가지의 백혈구 감별 기준을 벗어나는 세포는 LUC (Large unstained cell)로 표시된다. 반면 수기법은 관찰되는 모든 형태를 표시할 수 있다.

정상인의 백혈구 감별계산은 자동장비가 정확하지만, 비정상 세포가 존재하거나 페록시다제 효소 등이 부족한 백혈구가 있을 때는 수기법이 더 정확하다. 전체적으로 수기법은 정확도는 높지만 정밀도가 낮고, 자동장비는 정밀도는 높지만 때때로 부정확하다. 자동혈구측정기는 분엽 호중구(Segmented neutrophil)와 간상(杆狀, band) 호중구를 포함한 미성숙 호중구를 감별하지 못하지만 좌방이동 지수를 산출하는 기능이 있다. 비정형 림프구(atypical lymphocyte), 비정형 단구 그리고 미성숙 모세포(blast)는 LUC로 표시된다.

자동혈구측정기에서 유핵적혈구는 림프구로 계산되므로 백혈구 수와 림프구 백분율이 실제보다 높게 되므로 일정 수준 이상이면 교정하여 보고한다. 그러나 최근의 자동혈구측정기는 유핵적혈구 지수인 nRBC를 산출한다. 자동혈구측정기에서 비정상 백혈구 감별지수가 표시될 때는 수기법으로 확인해야 한다. 자동혈구측정기의 백혈구 산출을 수기법으로 확인하는 기준은 병원에 따라 다르겠으나 신환일 경우에 비정상 백혈구 감별지수가 나타나는 경우는 항상 수기법으로 확인해야 한다.

5) 자동혈구분석기를 이용한 망상적혈구 분석 

백혈구감별계산에 적용되는 원리와 같은 방법으로 망상적혈구를 측정하고 분석한다. 이에 따라 수기법보다 정확도나 재현성이 현저하게 개선될 수 있었다. 자동분석기 모델에 따라 약간씩 다르지만 검사과정은 반자동 또는 자동식이다. 염색 시약을 첨가하여 적혈구의 RNA 양을 측정하는데 Advia 1210은 Oxazine 750,  Cell Dyn은 CD4K 530, GEN-S는 new methylene blue  (NMB), Sysmex 계열은 auramine O, VEGAS RETIC은 thiazole orange를 사용한다. 측정방법으로 Advia 1210은 광흡수, GEN-S는 광산란, 그리고 나머지 세 회사의 기종은 형광(fluorescence)를 측정한다.

국내에서 가장 많이 사용되는 Sysmex 장비에서는 hydrodynamic focusing을 결합한 유세포분석(flow cytometry)에 기초한 것인데세포내 RNA는 argon laser light에서 형광을 내는 auramine O로 염색하게 된다. 여기서 망상적혈구는 LFR, MFR, HFR 등 세 분획으로 나누는데 미성숙 분획인 IRF는 MFR과 HFR을 합한 것이다. 치료중인 환자에서 IRF가 5% 이상일 경우 골수는 조혈능 회복기에 접어들었다는 것을 의미한다. 

망상적혈구 분획(reticulocyte fraction, RF)은 RNA 양에 따라 구분되는데 미성숙도가 높을수록 망상체(reticulin)의 양도 많게된다. 미성숙망상적혈구분획(immature reticulocyte fraction, IRF)이란 가장 염색성이 강하고 초기 성숙단계의 적혈구로 정의된다. 이 파라미터는 적혈구 생성의 초기단계를 의미하는데 화학요법제나 erythropoietin 치료, 조혈모세포이식 후 회복기의 골수 조혈상태을 반영한다. 

또한 망상적혈구 절대치와 비교하여 빈혈을 감별진단하는데도 사용할 수도 있다. 망상적혈구 혈색소양(reticulocyte hemoglobin content, CHr)은 저색소성 적혈구(hypochromic RBC)를 확인하기 위한 예민한 지표이다. 이는 철결핍빈혈을 찾아내고, 철 치료에 적절하게 반응하는가를 추적하는데 이용될 수 있다.

참고  http://ajcp.ascpjournals.org/content/117/6/871.full.pdf

 

 Delta neutrophil index (DNI)

DNI는 cytochemical myeloperoxidase (MPO) 채널에 의해 측정된 과립구와 백혈구의 핵 엽상(Baso/Loburaity) 채널에서 측정된 과립구 차이를 나타낸 것으로 미성숙 과립구 수를 반영한 수치이다. 다시 말해서 DNI는 기존의 CBC 결과 항목 중 호중구와 호산구, 다형핵백혈구 백분율을 이용하여 만든 지표이다.  

Siemens ADVIA 2120i Hematology System에서만 제공되는 결과치인데, 이 DNI 은 band neutrophil, metamyelocyte,  myelocyte, promyelocyte 등의 미성숙 과립구를 의미한다. 이러한 미성숙 과립구를 감염과 패혈증의 표지자로 활용한 것이다.

▶ADVIA 2120i에서 DNI 산출 공식
     Delta Neutophil I(DNI) = (Neu% + Eo%) - PMN %
     Delta Neutophil II(DNII) = (Neu%+Eo%+LUC%)-PMN %

▶임상적 의의 및 활용
- 자동화로 전신성염증반응증후군(SIRS), 패혈증의 중증도 및 추적검사
- 백혈구, 중성구가 정상인 경우에도 패혈증 여부 스크리닝
- 바이러스와 세균성 감염증 감별진단

●자동혈구측정기의 오차원인
 

1) 응고된 혈액 :  항응고제의 혼합 잘못, CBC bottle내의 항응고제와 혈액의 양이 맞지 않을 경우, 

    혈소판의 병적인 증가나, 혈소판 형태나 기능상 이상이 있을 경우​

2) 혼합의 불충분 : 검사전 검체를 3-5분간 혼합 할 것
3) 백혈병, 빈혈, 암, DIC, 동맥경화증 등의 질병에서 고지혈증 혹은 다른 이상 물질들의 증가로

    세포들이 엉키고 세포막에 이물질이 피복되어 기계의 chamber내 세공을 막아 오차 유발
4) 시약 부족 : Isoton, Lyse 등
5) 혈구응집 :  혈소판 응집(clumping) 또는 로젯(rosette) 형성시 백혈구가 증가하고,
    연전현상(rouleaux formation), 한냉응집소(cold agglutinin)가 있을 경우 
6) 그 외 요독증(uremia)이나 여러가지 약물도 오차 원인이 될 수 있다.

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해결방법은 먼제 검체확인 기준에 따라 육안으로 고지혈 혈장이나 황달기를 보이는(icteric) 혈장을 확인한다. 그리고 이전 검사에서  혈청 빌리루빈이 10mg/dL 이상 또는 , 단클론성 감마글로불린 1g/dL 이상,  MCH 증가나, MCHC >36g/dL의 검체도 걸러낸다. 이들 검체를 재검하는데 검체는 원심분리후 혈장을 동량의 PBS로 대체하여 혼합한 후 검사한다.  

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CBC 결과는 항상 이전 결과와 비교하여 확인하고 보고한다. 한냉응집소로 인해 적혈구응집을 보이는 경우는 검체를 37에서 한 시간 동안 가온 시킨 후 꺼내어 즉시 검사를 시행한다. 검체 문제로 인한 검사결과에 오류를 예방하기 위한 전산시스템 활용도 적극적으로 고려하도록 한다.

●회사별 자동혈구분석기 최신 기종

    Automated blood counting analyzers

Beckman Coulter (Fullerton, CA) ------ LH755,  DxH 800

Sysmex Corporation (Kobe, Japan) -- XN series (XN 1000, 2000, 3000, 9000)

Siemens (Tarrytown, NY) ----- ---------- ADVIA  120/2120/2120i

Abbott Diagnostics (Mountain View, CA) ----- Cell-Dyn Sapphiire

ABX (Montpelier, France) ---------------- Pentra DX-DF 120

Mindray (Shenzhen, Cina) --------------  BC-6800, BC-6200

*** 장비간의 분석평가 방법 :  직선성(linearity), 정밀도(precision), 기기간 일치율(inter-instrument agreement), 백혈구 감별계산(WBC differential), 검체간 상호오염도(carryover)를 평가

(예) Mindray BC-6800 자동혈구분석기의 유용성 평가   자동혈구분석기 Cell-Dyn Saphphire 평가

 강동성심병원 Coulter 880 (1986년 도입 당시)         Siemens Advia 120 (2000)